Princípios da Síntese de Ácido Nucleico

A síntese de ácido nucleico é realizada usando o método de triglicerídeo de amida siálica em fase sólida, em que a extremidade 3' do DNA é imobilizada em um substrato de fase sólida e os nucleotídeos são adicionados na direção 3' para 5' até que o fragmento de DNA desejado seja sintetizado. .Isto difere da síntese de DNA pela aplicação de DNA polimerase.

A extremidade 3' da primeira base é imobilizada no CPG durante a síntese, o 5'-OH da base seguinte é protegido com di-p-tolil tritil DMT, o grupo amino na base é protegido com ácido benzóico e o 3' -OH é então ativado com um composto aminofosfato.1 base do 5 5'-OH de 1 base e 3'-OH da próxima base formam um triglicerídeo fosfito, que é então oxidado com iodo a um triglicerídeo fosfato, o protetor na segunda base 5'-OH é removido por a adição de ácido dicloroacético DM percorre a adição da próxima base e, após a síntese, o protetor no 5'-OH é removido com um ácido fraco O fragmento é desconectado da resina sólida com hidróxido de amônio concentrado, o protetor é removido da base com hidróxido de amônio concentrado sob aquecimento, o hidróxido de amônio é removido, o fragmento é seco a vácuo e o ácido nucleico é purificado por cromatografia líquida ou PAGE.

Etapas da síntese de Oligo

Desbloqueando

OO grupo protetor de DMT de 5 extremidades é removido pela adição de solução de TCA.

Ativação

Misturar o ativador com o monômero oligonucleotídico para formar o monômero oligonucleotídico intermediário ativo.

Acoplamento

O grupo hidroxila 5-terminal reage com o oligonucleotídeo intermediário ativo em uma reação de condensação anti-generativa para formar uma ligação fosfito triglicerídeo instável.

Limite 

A adição de um agente de proteção realiza uma reação de proteção de acetilação com excesso de grupos hidroxila que não estão envolvidos na reação de condensação.

Oxidação 

A adição de solução de iodo contendo água reage com ligações instáveis ​​de fosfito por oxidação para formar ligações estáveis ​​de triglicerídeos de ácido fosfórico.

Clivagem de cianoetila

O produto de ácido nucleico após a síntese, com a adição de solução DEA para remover o grupo cianoetila da ligação triglicerídeo fosfato.

Clivado e Desproteção

Os fragmentos de ácido nucleico são clivados do transportador de fase sólida pela adição de uma solução concentrada de hidróxido de amónio e depois aquecidos para remover os grupos protectores das ligações de hidrogénio das bases.